多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是臨床常見的內分泌及代謝紊亂性疾病，病因尚不清楚，在育齡婦女中較為高發，以卵泡發育障礙、胰島素抵抗和高雄激素血癥為主要特征。PCOS是當代生殖醫學領域研究的熱點之一。當PCOS不孕患者經過標準促排卵治療仍未妊娠，或合并其他助孕指征，可行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕治療。在IVF控制性超促排卵（COH）過程中，常常在卵泡接近成熟時使用外源性人絨毛膜促性腺激素（hCG）以模擬內源性黃體生成素（LH）峰作用，促進卵泡最后的成熟，稱為hCG扳機，因此，hCG扳機時間至關重要。臨床上在至少3個主導卵泡徑線≥17 mm或者2個主導卵泡徑線≥18 mm時考慮行hCG扳機。扳機日除了要關注卵泡直徑還應重視成熟卵泡數量，既要獲得足夠數量的成熟卵子又不降低卵子質量，目前國內外尚無統一標準。有研究認為妊娠率隨著成熟卵泡比例的增加而升高，也有研究認為高成熟卵泡比例組卵子發育潛能反而降低。關于PCOS患者hCG注射日成熟卵泡比例對妊娠結局的影響研究甚少。2011年Genro等首次提出卵泡輸出率（FORT）的概念，即hCG注射日雙側卵巢排卵前16~22 mm 卵泡個數與促排卵前2~8 mm竇卵泡個數的百分比，用于評估不孕患者卵巢反應性及妊娠結局。在COH周期中，同一批發育的徑線稍小的卵泡（例如直徑14~16 mm）也可獲得成熟卵母細胞，hCG注射后這部分卵泡將會進一步發育成熟，因此本研究采用直徑≥14 mm的卵泡數計算hCG注射日成熟卵泡數占比和FORT，并分析其對PCOS患者卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植妊娠結局的影響，為控制性促排卵的治療提供臨床依據。
資料與方法
1.研究對象及分組：回顧性隊列研究分析2017年5月至2018年5月期間在鄭州大學第三附屬醫院生殖醫學中心接受卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植的PCOS患者的臨床資料。納入標準：①符合鹿特丹診斷標準，診斷為PCOS；②具有IVF/卵胞質內單精子注射（ICSI）指征；③卵泡期長效長方案降調節；④hCG扳機后取卵并行新鮮胚胎移植患者。排除標準：①子宮及卵巢手術史；②子宮內膜異位癥；③子宮腺肌病；④雙側輸卵管積水；⑤復發性自然流產等。根據hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數占比［（hCG注射日直徑≥14 mm的卵泡數/hCG注射日卵泡總數）×100%］分為3組：A組，比例≤60%；B組，比例為60%~80%；C組，比例≥80%。根據FORT（hCG注射日直徑≥14 mm的卵泡數/促排卵前竇卵泡總數×100%）分為3組：D組，比例≤40%；E組，比例為40%~60%；F組，比例≥60%。根據移植結局，將患者分為妊娠組及未妊娠組。本研究符合《赫爾辛基宣言》基本原則。
2.COH方案：所有患者均于月經周期第2~3日肌內注射長效促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達菲林，法國益普生）3.75 mg降調節，約于降調節30 d查血清激素［卵泡刺激素（FSH）、雌二醇、孕酮、LH］及陰道超聲，若達降調節標準（FSH≤5 IU/L、LH≤5 IU/L、雌二醇<50 ng/L、孕酮<1 µg/L、內膜厚度≤5 mm、雙側竇卵泡直徑≤5 mm），加用促性腺激素（Gn）進行COH，每日給予重組FSH（果納芬，瑞士默克雪蘭諾）促卵泡發育。根據患者的年齡、基礎竇卵泡數（AFC）、生殖激素水平、體質量指數（BMI）和卵巢功能決定其起始劑量，根據卵泡發育情況適時添加人絕經期促性腺激素（hMG，珠海麗珠制藥），根據卵泡發育大小及血清LH、雌二醇水平調整Gn用量和使用時間。
3.取卵、IVF及胚胎移植：患者雙側卵巢至少2枚卵泡直徑達18~20 mm以上時，結合雌二醇水平確定“hCG扳機”時間，當晚皮下注射艾澤（瑞士默克雪蘭諾）250 μg，注射后36~38 h 經陰道超聲引導下取卵。取卵當日給予黃體支持，黃體酮凝膠（瑞士默克雪蘭諾）1支/d陰道給藥。同時男方取精，行IVF或ICSI授精，取卵后3~5 d行新鮮胚胎移植。新鮮胚胎移植后14 d檢測血清β-hCG水平確定是否妊娠，若血清β-hCG≥5 IU/L，則判定為生化妊娠；移植后30~35 d行B超檢查，超聲下見孕囊為臨床妊娠。
4.臨床及實驗室各項指標的觀察：患者的一般情況，包括年齡、基礎FSH（bFSH）、BMI、不孕年限和AFC。COH監測指標，包括Gn總量、Gn啟動量、Gn使用時間、hCG注射日雌二醇、LH和孕酮水平。實驗室指標，包括獲卵數、雙原核（2PN）受精率、可利用囊胚形成率（可利用囊胚為囊胚腔評分為3期及以上，內細胞團或滋養層細胞其中之一的評分高于C級的囊胚）、移植胚胎數、移植日子宮內膜厚度。胚胎移植結局監測指標，包括胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、活產率和卵巢過度刺激綜合征（OHSS）發生率等。2PN受精率=2PN數/獲卵數×100%；可利用囊胚形成率=可利用囊胚形成數/囊胚培養數×100%；胚胎種植率=超聲見孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；流產率=流產周期數/移植周期數×100%；活產率=活產周期數/移植周期數×100%；OHSS發生率=OHSS發生周期數/移植周期數×100%。
5.統計學方法：采用SPSS21.0統計學軟件進行分析，計量資料符合正態分布時以均數±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。臨床妊娠的影響因素分析采用二元logistic回歸分析法。P<0.05表示差異有統計學意義。
結果
1. hCG注射日直徑≥14 mm卵泡占比分組各項指標的比較：A組的Gn使用時間與Gn總用量大于B組和C組（P<0.001），但Gn啟動劑量低于B組和C組（P=0.026），B組和C組間差異均無統計學意義（P>0.05）。hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及獲卵數隨著hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數占比的增加而增加（P<0.001）。A組2PN受精率小于B組（P=0.013），余組間差異無統計學意義（P>0.05）。3組間可利用囊胚率、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、活產率差異均無統計學意義（P>0.05）；C組的OHSS發生率顯著大于A組（P=0.008），余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。
2. 根據FORT分組各項指標的比較：D組的Gn使用時間與Gn總用量大于E組和F組（P<0.001），F組的Gn啟動劑量大于E組和F組（P=0.019）；隨著FORT的增加，hCG注射日雌二醇水平、hCG注射日孕酮水平及獲卵數隨之增加（P<0.001）；F組2PN受精率明顯低于D組（P=0.009）和E組（P<0.001），D組與E組間差異無統計學意義（P>0.05）；F組胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率低于E組（P=0.002、P=0.007、P=0.011），D組與其他兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）；F組的OHSS發生率顯著大于D組（P=0.010），余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。
3. 妊娠組與未妊娠組臨床及實驗室各項指標的比較：妊娠組2PN受精率和可利用囊胚率高于未妊娠組（P=0.041，P<0.001）；未妊娠組FORT高于妊娠組（P=0.031），而hCG注射
日直徑≥14 mm卵泡數占比組間差異無統計學意義（P>0.05）；在年齡、BMI、AFC、獲卵數等方面，兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）（表3）。
4. 影響臨床妊娠相關因素的二元logistic回歸分析：以臨床妊娠與否為因變量，校正混雜因素（年齡、AFC、獲卵數、2PN受精率、可利用囊胚率等）后結果顯示AFC、可利用囊胚率、FORT對臨床妊娠的影響有統計學意義，其余指標對臨床妊娠結局的影響無統計學意義（表4）。
討論
PCOS不孕患者首要的治療方法是誘發排卵，當通過調整生活方式與促排卵失敗時，或當患者合并有其他助孕指征時，可以考慮進行IVF治療。由于PCOS患者特殊的內分泌紊亂，其對藥物的反應性無法預測，在促排卵的過程中容易出現多卵泡發育、卵子質量下降、OHSS等風險，或者對促排卵藥物不反應或卵泡期過長，提早黃素化等，合適的COH方案及hCG扳機時機至關重要。本研究分別按hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數占比和FORT分為高、中及低比例組，研究各組對卵泡期長效長方案新鮮胚胎移植妊娠結局的影響。
先前的研究以及臨床治療中，多采用年齡、AFC、bFSH、抗苗勒管激素（AMH）等指標來預測卵巢的反應性及妊娠結局，Genro于2011年最早提出了FORT的概念，并將其用之于臨床。Rehman等和Gallot等認為，FORT可以預測獲卵數、胚胎質量及妊娠結局。Hassan等認為，FORT是影響臨床妊娠率的獨立因素，隨著FORT值增大，獲卵數和優質胚胎數增加，種植率和妊娠率增高。Zhang等認為PCOS患者的中比例FORT和非PCOS患者的高比例FORT可以得到更好的妊娠結局，這與卵巢反應異質性有關。本研究顯示妊娠組FORT顯著低于未妊娠組，FORT高比例組（F組）2PN受精率低于FORT中、低比例組（D和E組），FORT高比例組（F組）臨床妊娠率及活產率低于FORT中比例組（D組），得知中、低比例的FORT可獲得較好的妊娠結局。卵巢功能正常的患者竇卵泡數相對有限，FSH受體飽和后，產生的雌激素量與之相對應，雌激素分泌高峰維持24 h左右后逐漸下降。PCOS患者的AFC是正常患者的2~3倍，Gn刺激大量卵巢顆粒細胞分泌雌二醇，使其劑量明顯增加，雌激素的分泌在達到峰濃度之后會呈現顯著下降趨勢。有學者認為注射hCG前雌激素的下降與卵泡閉鎖或提前黃素化有關，最終導致低受精率和卵裂率，故妊娠率降低。hCG注射日高濃度雌二醇水平也可能通過影響卵子質量、胚胎發育或子宮內膜容受性影響輔助生殖的結局。以往文獻指出高雌激素患者雖可獲得較多卵子，但會產生不成熟或過熟卵子，這些卵子受精后分裂不佳，形成低質量胚胎；一個COH周期有過多的卵子發育成熟，可能使質量差的卵子比例增高，導致可利用胚胎率降低。另外高FORT組大卵泡比例增高，當卵泡超過一定徑線時容易出現黃素化和卵母細胞老化，從而導致卵母細胞質量下降，優質胚胎數目減少，并最終影響患者的妊娠結局。過高的血清雌二醇水平可以改變與著床密切相關的分子、發育基因以及子宮內膜超微結構的時序性表達，使子宮內膜組織學變化與正常生理改變不符，導致腺體發育和間質發育的不同步，使種植窗的開放與胚泡的發育不同步，影響胚胎著床，最終影響妊娠結局。
有研究表明在GnRH-a長方案中，hCG注射日成熟卵泡比例（≥18 mm/≥10 mm）對PCOS患者臨床妊娠結局無影響，延遲hCG扳機時間可能會增加OHSS的風險，這與本研究結論一致。本研究結果顯示隨著hCG注射日卵泡直徑≥14 mm數占比升高，獲卵數增加，可移植胚胎數隨之增加，可能會提高累積妊娠率，但不影響臨床妊娠率和活產率。在COH過程中，使用促排卵藥物刺激多個卵泡共同發育，由于每個卵泡對FSH的敏感性不同，對FSH敏感的卵泡逐漸發育成優勢卵泡，其他卵泡則可能發育緩慢或逐漸閉鎖。因此hCG注射日監測到的卵泡總數一般低于AFC，這使hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數占比相較于FORT比例重新分配，得出不一樣的結論。數據分析可見在hCG注射日卵泡直徑占比分組下，各組數據差距較FORT分組小，高比例組與FORT中比例組的獲卵數、臨床妊娠率及活產率相近。得知卵泡直徑占比這種分組方式縮小了組間差異，對臨床妊娠率和活產率沒有明顯影響。
除了FORT可預測妊娠結局，logistic回歸分析提示AFC與臨床妊娠密切相關。Holte等的大樣本前瞻性研究結果顯示PCOS患者助孕治療后的妊娠率及活產率與AFC呈線性正相關。另有研究表明，PCOS患者的獲卵數雖然在增加，但卵母細胞的質量較差，從而導致受精率、卵裂率和種植率降低。這可能是因為卵巢內因素［表皮生長因子（EGF）、成纖維生長因子（FGFs）、胰島素樣生長因子（IGF）家族、神經生長因子（NGF）家族、轉化生長因子（TGF）-β家族、血管內皮生長因子（VEGF）家族、細胞因子家族］和卵巢外因素（FSH缺乏、高LH、高雄激素、高胰島素）對卵母細胞的成熟和胚胎潛在發育能力產生負面影響。回歸分析還表明獲卵數與臨床妊娠關系不大，可能因為PCOS患者促排卵后能獲得可觀的胚胎數量，選擇優質胚胎進行移植是IVF成功的關鍵。在IVF過程中，仍要注意把握卵巢刺激的強度，不宜過多或過少，不僅要使患者一次取卵周期獲益最大化，同時要兼顧胚胎利用率、OHSS風險等方面，制定個體化的促排卵方案。
目前應用于PCOS患者的促排卵藥物及促排卵方案較多。隨著臨床研究的深入，COH方案在長方案基礎上又衍生出拮抗劑方案、微刺激方案、長效長方案、超長方案等，各個方案各有其優劣勢。本研究僅選取行卵泡期長效長方案降調節的患者進行研究，其他方案值得進一步探討。卵泡期長效長方案通過充分降調節，更理想地控制了PCOS患者異常激素水平，盡可能使多的卵泡發育成熟，同時推遲注射hCG可獲得更多的成熟卵子，發生黃素化概率低，對子宮內膜容受性的影響小，但獲卵數的增多，亦會增加OHSS的風險［23］。PCOS是發生OHSS的高危因素之一，目前OHSS缺乏針對性強的治療方法，預防尤為重要。對PCOS患者，應當減少Gn用量；當卵泡近成熟，血清雌激素水平過高時，可短暫停用Gn，也稱“coasting”；出現嚴重OHSS傾向時，可取消周期；減少hCG的扳機劑量，取卵后禁用hCG進行黃體支持等。這些方法都能一定程度降低OHSS的發生率。阿司匹林、二甲雙胍等藥物的使用也可預防OHSS的發生。另外，妊娠導致內源性hCG大量分泌，可誘發加重OHSS的發生發展，選擇性的全部胚胎冷凍可以避免因妊娠而引起的遲發型OHSS。對于已發生OHSS的患者，應積極對癥治療，減少嚴重并發癥的發生，以減輕患者痛苦，最終實現患者的生育目的。
綜上所述，在PCOS患者中，hCG注射日直徑≥14 mm卵泡數占比不影響妊娠結局，FORT對于預測妊娠結局具有重要意義，中低比例FORT的患者可有較好的妊娠結局。本研究僅為回顧性研究，仍有待大樣本、多中心、前瞻性研究進一步證實。
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